單細胞蛋白質組學是人們研究的熱點，目前已可以實現(xiàn)單個細胞4000-5000種蛋白質檢測（>>>點擊直達：4000+ | 單細胞蛋白質組，你也需要升級迭代！）。隨著技術的快速發(fā)展，超微量的前處理技術和超高靈敏度的質譜技術推動了研究者們從單細胞中挖掘更多的信息。

2024年7月19日，美國明尼蘇達州梅奧診所實驗室的研究者們在Communications biology上發(fā)表論文[1]，探討了蛋白翻譯后修飾、突變肽等的單細胞異質性問題。

梅奧診所的研究團隊在前期實驗中通過優(yōu)化捕獲離子遷移譜 (TIMS) 的設置，證明了在無標記模式下以單細胞分辨率檢測磷酸化和乙?；目尚行訹2]。該研究團隊使用timsTOF SCP質譜儀對人類正常膽管細胞系和膽管癌細胞系進行了單細胞蛋白質組和 PTM 分析，包括磷酸化、甲基化和乙酰化，除此之外還首次進行了癌細胞常見突變蛋白的突變肽分析，以及單細胞核蛋白質組學的嘗試。

單細胞蛋白質組學

圖1. 單細胞蛋白質組學工作流程

根據(jù)工作流程（圖1），作者采用了數(shù)據(jù)非依賴采集 (DIA) 并行積累-連續(xù)碎片 （diaPASEF） 模式進行質譜檢測。相比大細胞量蛋白質組學DDA數(shù)據(jù)建庫的結果，作者發(fā)現(xiàn)2~5ng蛋白量（大約20~50個細胞）DDA檢測建庫能實現(xiàn)最大蛋白質組覆蓋率，且與不建庫模式相比，建庫后基于庫的蛋白鑒定數(shù)量明顯更多（圖2）。

圖2. diaPASEF建庫蛋白輸入量探索（使用DIA-NN搜庫）

作者對正常人膽管細胞系 (NHC) 和三種膽管癌細胞系 (HuCCT-1、RBE 和 EGI-1) 進行了單細胞蛋白質組分析。從 200 個單細胞中共鑒定出 4197 種蛋白質（41,560種肽），平均每個細胞 2548 種蛋白質（圖3）。降維聚類結果顯示正常細胞（NHC）和癌細胞分離，三種癌細胞有一定程度分離。差異表達分析顯示，與正常細胞相比，癌細胞中 84 種蛋白質上調，131 種蛋白質下調。蛋白質的亞細胞定位顯示，大多數(shù)已鑒定的蛋白質（56%）屬于細胞質，其次是細胞核（27%）和質膜（8%），鑒定的蛋白質中，酶占大多數(shù)（961 種蛋白質），還伴有 262 種轉運蛋白、227 種轉錄調節(jié)因子、145 種激酶和 64 種磷酸酶。

圖3.單細胞蛋白組基本分析（PCA降維聚類、差異分析、蛋白亞細胞定位、蛋白功能注釋）

單細胞PTM分析

除了單細胞蛋白表達分析，作者還對數(shù)據(jù)進行蛋白翻譯后修飾分析。共鑒定出 192 種磷酸化肽（116 種蛋白質的 182 個位點）、24 種賴氨酸甲基化肽（19 種蛋白質的 24 個位點）、20 種賴氨酸二甲基化肽（13 種蛋白質的 17 個位點）、14 種賴氨酸三甲基化肽（10 種蛋白質的 11 個位點）、17 種賴氨酸乙?；模?3 種蛋白質的 14 個位點）和 16 種賴氨酸甲?；模?2 種蛋白質的 16 個位點）（圖4）。不富集直接搜庫的結果顯示本方法可以檢測到蛋白的多個修飾位點，例如鑒定出核仁素的四個磷酸化位點（Ser 67、Thr 76、Thr 121 和 Ser 563），這些鑒定結果通過合成肽的洗脫時間和碎片離子得到證實（圖4a）。還檢測到了組蛋白和延伸因子 1-alpha 1 等蛋白的多種 PTM，例如在組蛋白 3.1 的賴氨酸（K14、K23、K27 和 K79）上檢測到了甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和甲?；任宸N類型的 PTM（圖4b）。組蛋白 H3 修飾會影響基因表達，例如 H3K14 乙?；c基因表達激活相關，已知后者與 H3K23 乙?；泊娌⑴悸?lián)；H3K79 甲基化與活性基因的轉錄區(qū)相關；而 H3K27 甲基化通過接近或環(huán)化沉默基因表達相關，并且 H3K79 甲酰化被認為可能沉默基因表達。因此，作者利用單細胞水平的組蛋白 H3 修飾數(shù)據(jù)，計算了激活基因表達與抑制基因表達的 PTM 比率以觀察細胞整體的轉錄活性（圖4c）。從結果能觀察到較高的比率可能表明大多數(shù)細胞的轉錄活性較高，這證實了所研究的細胞是增殖性腫瘤細胞系。以上的結果顯示：以單細胞水平的組蛋白修飾作為介質，有可能在單細胞分辨率下揭示由基因調控和轉錄活性驅動的單個細胞狀態(tài)。

圖4. 單細胞數(shù)據(jù)中鑒定出的蛋白質、磷酸化、N 端乙?；?、賴氨酸單甲基化、二甲基化、三甲基化、乙?；图柞；牡臄?shù)量

單細胞突變肽分析：單一氨基酸多態(tài)性SAP

作者通過整合上述三種癌細胞系體細胞單核苷酸變異 (SNP) 數(shù)據(jù)庫 (depmap.org)，檢驗了在單細胞水平上檢測具有單一氨基酸多態(tài)性 (SAP) 肽的可行性。通過分析合成肽混合物并評估洗脫時間和碎裂模式的相似性來鑒別這些肽（圖1）。作者在單細胞水平上成功地鑒定了含有與 G12D 相對應的 KRAS 變異的肽以及其他三種變異——IQGAP1 G1047R、CCT8 A488T 和 GMPS R435T（圖5a）。重要的是，具有 KRAS G12D 變異的肽 LVVVGADGVGK 僅在 HuCCT-1 和 EGI-1 細胞中檢測到，而未在 RBE 細胞中檢測到，這與 DepMap 中注釋的基因組測序結果一致。同樣，源自 CCT8 A4888T 變異的肽 NVGLDIEAEVPTVK 僅在 RBE 細胞中檢測到，這再次與 DepMap 中的數(shù)據(jù)一致。隨著單細胞蛋白質組覆蓋深度的不斷發(fā)展，更多來自其他類型變異（如插入/缺失和融合基因）的肽可能會被檢測到。

圖5. 以單細胞分辨率識別 SAP

單個細胞核的蛋白質組學與PTM分析

單細胞轉錄組學發(fā)展出了單細胞核轉錄組學，單細胞蛋白質組學能不能也發(fā)展出單細胞核蛋白質組呢？作者嘗試按照snRNA-seq的方法制備了用他澤司他處理的漿液性卵巢癌細胞系 PEO1的單細胞核懸液，他澤司他是一種臨床批準的組蛋白甲基轉移酶 EZH2 的表觀遺傳抑制劑，可甲基化組蛋白 3.1 的賴氨酸 27（圖6a）。按照上述的方案，生成了30個單核樣本的 diaPASEF 數(shù)據(jù)，處理組和對照組分別有15個細胞核，共計得到 6221 個肽，對應 1008 種蛋白質，平均每個樣本 627 種蛋白質（圖6c）。重點是作者在 K14、K23、K27 和 K79 鑒定出組蛋白 H3.1 的六種不同 PTM，其中大多數(shù)在每個單核樣本中都能檢測到（圖6d）。他澤司他治療后，H3K27 的三甲基化水平降低，而組蛋白 H3.1 的總蛋白質豐度沒有顯著變化（圖6e）。上述結果證明：單核蛋白質組學不僅可行還可以通過檢測組蛋白修飾來研究可能影響基因表達的藥物的具體機制。

圖6. 單核蛋白質組和 PTM 分析

總結

本研究進行了單細胞/單細胞核蛋白質組學、單細胞/單細胞核蛋白翻譯后修飾組學以及單細胞SAP分析研究，證明了單個細胞甚至單個細胞核的超低微量蛋白質能夠應用于蛋白質組學和蛋白翻譯后修飾研究，使得單細胞蛋白質組學的研究向前又邁了一步。

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參考文獻

[1] Mun, DG., Bhat, F.A., Joshi, N. et al. Diversity of post-translational modifications and cell signaling revealed by single cell and single organelle mass spectrometry. Commun Biol 7, 884 (2024).

[2]Mun, D. G. et al. Optimizing single cell proteomics using trapped ion mobility spectrometry for label-free experiments. Analyst 148, 3466–3475 (2023).