頂復(fù)門寄生蟲(chóng)（如弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)）是著名的“細(xì)胞吸血鬼”，專性宿主細(xì)胞內(nèi)寄生，可引發(fā)弓形蟲(chóng)病、瘧疾等致命疾病。頂復(fù)門原蟲(chóng)的線粒體基因組極度精簡(jiǎn)，僅剩3個(gè)蛋白編碼基因（cox1、cox3和cob）和一堆“碎成渣”的線粒體rRNA片段。這些高度碎片化的線粒體rRNA如何拼成功能完整的線粒體核糖體？這一謎題困擾學(xué)界多年。

2024年12月17日，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所、瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)和法國(guó)波爾多大學(xué)團(tuán)隊(duì)，在《Nature Communications》（IF：14.7）發(fā)表題為“Apicomplexan mitoribosome from highly fragmented rRNAs to a functional machine”重磅研究，文章通過(guò)CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析等多學(xué)科方法，首次揭示了頂復(fù)門原蟲(chóng)（剛地弓形蟲(chóng)）線粒體核糖體的“分子拼圖”奧秘，并且鑒定出四個(gè)具有AP2結(jié)構(gòu)域蛋白在維持蟲(chóng)體線粒體核糖體結(jié)構(gòu)和功能中的關(guān)鍵作用。該項(xiàng)研究為開(kāi)發(fā)針對(duì)弓形蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)的新型治療策略提供了新的分子靶點(diǎn)。

青蓮百奧為該研究提供了定量蛋白組學(xué)分析服務(wù)。

樣本信息

• 研究對(duì)象：頂復(fù)門原蟲(chóng)代表—弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）和伯氏瘧原蟲(chóng)（Plasmodium berghei）

• 關(guān)鍵樣本：條件性敲低（conditional knockdown）四個(gè)線粒體AP2蛋白（mtAP2-1至mtAP2-4）的轉(zhuǎn)基因蟲(chóng)株

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

CRISPR/Cas9基因編輯、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）、免疫共沉淀（IP）和質(zhì)譜分析（MS）、定量蛋白組（LC-MS）、RNA免疫共沉淀測(cè)序（RIP-Seq）和冷凍電鏡（Cryo-EM）。

研究亮點(diǎn)

• AP2/ERF家族蛋白新角色：傳統(tǒng)上在植物和頂復(fù)門原蟲(chóng)中充當(dāng)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的AP2/ERF家族蛋白，在頂復(fù)門原蟲(chóng)線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫€粒體核糖體大小亞基的構(gòu)成蛋白；首次發(fā)現(xiàn)AP2功能域可與RNA分子結(jié)合。

• 高度碎片化的線粒體rRNA組裝：揭示弓形蟲(chóng)利用40多個(gè)mt-rRNA片段和122個(gè)核編碼線粒體核糖體蛋白組裝出完整功能核糖體的機(jī)制。

• 獨(dú)特線粒體核糖體結(jié)構(gòu)：通過(guò)單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，首次解析了頂復(fù)門原蟲(chóng)代表-弓形蟲(chóng)線粒體核糖體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，為目前已報(bào)道的核糖體和線粒體核糖體中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的核糖體。

研究結(jié)果

一、四個(gè)具有AP2功能域的蛋白定位于線粒體并影響寄生蟲(chóng)存活

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定出在頂復(fù)門原蟲(chóng)中高度保守的四個(gè)具有AP2結(jié)構(gòu)域蛋白（mtAP2-1至mtAP2-4），并利用CRISPR/Cas9基因編輯、免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）和Split-GFP技術(shù)，確認(rèn)其定位于弓形蟲(chóng)線粒體基質(zhì)。基因條件性敲低實(shí)驗(yàn)表明，mtAP2蛋白的缺失會(huì)顯著降低寄生蟲(chóng)的復(fù)制能力。該生長(zhǎng)缺陷可通過(guò)野生型的回補(bǔ)完全恢復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，感染mtAP2-2缺失的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株的小鼠能存活并產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫反應(yīng)，而感染野生型或野生型基因回補(bǔ)株的小鼠則無(wú)法存活，證實(shí)了mtAP2-2在蟲(chóng)體毒力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

圖1 四個(gè)具有AP2功能域的蛋白在頂復(fù)門中高度保守。這四個(gè)蛋白定位于弓形蟲(chóng)的線粒體基質(zhì)中，其與蟲(chóng)體胞內(nèi)增殖和對(duì)小鼠致病性相關(guān)。

二、mtAP2蛋白不作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，但維持線粒體呼吸鏈復(fù)合體穩(wěn)定性

通過(guò)RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，mtAP2蛋白的缺失并未顯著影響蟲(chóng)體乃至線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平，表明其不作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。然而，mtAP2蛋白的缺失導(dǎo)致蟲(chóng)體線粒體內(nèi)呼吸鏈復(fù)合體III和IV的亞基豐度顯著降低（蛋白組學(xué)結(jié)果），線粒體形態(tài)異常（腫脹、扭曲、嵴減少），同時(shí)線粒體能量代謝功能下降。此外，回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，野生型mtAP2蛋白能夠恢復(fù)敲低株的生長(zhǎng)缺陷，而缺乏AP2結(jié)構(gòu)域的突變體則無(wú)法恢復(fù)。這些結(jié)果表明，mtAP2蛋白對(duì)于維持呼吸鏈復(fù)合體III和IV以及蟲(chóng)體線粒體的功能至關(guān)重要。

圖2 四個(gè)mtAP2蛋白在弓形蟲(chóng)中并不充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，但其對(duì)維持蟲(chóng)體線粒體的形態(tài)和功能至關(guān)重要

三、四個(gè)mtAP2蛋白與線粒體核糖體互作并維持其完整性

通過(guò)IP-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)mtAP2蛋白相互作用的線粒體核糖體蛋白。結(jié)果顯示，mtAP2-1與小亞基（mt-SSU）蛋白特異結(jié)合，而mtAP2-2、mtAP2-3和mtAP2-4則與大亞基（mt-LSU）蛋白特異性結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，在MgCl2存在的情況下，所有mtAP2蛋白均與大小亞基蛋白相互作用，確認(rèn)它們是線粒體核糖體的組分。蔗糖梯度分離實(shí)驗(yàn)表明，mtAP2蛋白對(duì)線粒體核糖體亞基的完整性至關(guān)重要，任一mtAP2蛋白的缺失均會(huì)導(dǎo)致蟲(chóng)體線粒體核糖體亞基的解體。此外，通過(guò)RIP-seq技術(shù)鑒定出43個(gè)小RNA片段，其中17個(gè)屬于mt-SSU，26個(gè)屬于mt-LSU，并發(fā)現(xiàn)了7個(gè)新的小RNA片段。這些結(jié)果表明，mtAP2蛋白是線粒體核糖體的核心組分，對(duì)維持其完整性至關(guān)重要。

圖3 四個(gè)mtAP2蛋白為蟲(chóng)體線粒體核糖體的構(gòu)成蛋白

四、冷凍電鏡解析剛地弓形蟲(chóng)線粒體核糖體的結(jié)構(gòu)

為了深入了解四個(gè)mtAP2蛋白在整個(gè)線粒體核糖體中的分子位置，通過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)剛地弓形蟲(chóng)速殖子，并采用蔗糖梯度分離純化和冷凍電鏡技術(shù)解析其結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，單獨(dú)LSU的分辨率為2.89?，處于成熟線粒體核糖體中的SSU頭部、SSU主體和LSU三個(gè)部分的分辨率分別為3.6?、3.29?和3.11 ?。研究發(fā)現(xiàn)，SSU比LSU更大，呈該物種所特有的延長(zhǎng)的橢圓形頭部。同時(shí)，大小亞基中均含有大量頂復(fù)門原蟲(chóng)所特有的核糖體蛋白。SSU包含兩個(gè)富含蛋白質(zhì)的區(qū)域，呈現(xiàn)擴(kuò)展平臺(tái)和極短的h44區(qū)域，其中A位點(diǎn)高度保守。研究還發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲(chóng)線粒體核糖體大亞基的中央突起（CP）部分完全由蛋白構(gòu)成，內(nèi)部并不含有5S rRNA。弓形蟲(chóng)線粒體核糖體蛋白數(shù)目高達(dá)132個(gè)，其中近半數(shù)為頂復(fù)門原蟲(chóng)所特有蛋白。真核生物的線粒體核糖體通常含有2-3條線粒體核糖體RNA。弓形蟲(chóng)的線粒體核糖體RNA呈現(xiàn)高度碎片化，片段總數(shù)竟然高達(dá)40條以上。同時(shí)部分rRNA片段獨(dú)特，在細(xì)菌核糖體rRNA中未找到對(duì)應(yīng)片段，弓形蟲(chóng)線粒體核糖體RNA同時(shí)出現(xiàn)大范圍“刪減”，其總線粒體rRNA長(zhǎng)度顯著低于細(xì)菌核糖體。

圖4 籍借單顆粒冷凍電鏡技術(shù)首次解析了弓形蟲(chóng)線粒體核糖體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)

圖5 弓形蟲(chóng)線粒體核糖體的蛋白構(gòu)成及其呈高度片段化的線粒體核糖體rRNA片段

五、四個(gè)mtAP2蛋白在線粒體核糖體中組裝rRNA片段

研究者通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定了四個(gè)mtAP2蛋白在線粒體核糖體中的精確位置及其與線粒體rRNA片段的相互作用。mtAP2-1位于蟲(chóng)體線粒體核糖體小亞基的頭與體連接處，與SSUB和SSUD片段相互作用；mtAP2-2位于大亞基的CP區(qū)域，與RNA11和LSUA片段相互作用；mtAP2-3位于新生成肽通道出口的外側(cè)上方，與RNA13、RNA29和RNA38片段相互作用；mtAP2-4位于PTC下方的亞基內(nèi)側(cè)，與LSUA和RNA3片段相互作用。這些蛋白通過(guò)與rRNA片段的3'和5'末端結(jié)合，在線粒體核糖體成熟過(guò)程中對(duì)rRNA片段的組裝起關(guān)鍵作用。此外，剛地弓形蟲(chóng)線粒體核糖體還富含RAP和HPR家族的RNA結(jié)合蛋白，主要位于線粒體核糖體分子的外圍。這些發(fā)現(xiàn)表明，mtAP2蛋白不僅維持核糖體的結(jié)構(gòu)完整性，還可能參與調(diào)節(jié)大小亞基的結(jié)合。

圖6 四個(gè)mtAP2蛋白與線粒體核糖體rRNA片段相結(jié)合

研究結(jié)論

本研究首次揭示了頂復(fù)門原蟲(chóng)線粒體核糖體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和分子組裝機(jī)制，系統(tǒng)性地描述了高度碎片化的線粒體rRNA如何經(jīng)由AP2家族轉(zhuǎn)錄因子演化而來(lái)四個(gè)mtAP2蛋白協(xié)同諸多其他線粒體核糖體蛋白（mtRPs）組裝形成功能完備的蛋白翻譯機(jī)器。本研究為線粒體核糖體的組裝機(jī)制和適應(yīng)性進(jìn)化提供了新的理解，研究的突破性結(jié)果不僅填補(bǔ)了線粒體核糖體領(lǐng)域的關(guān)鍵空白，還為今后開(kāi)發(fā)針對(duì)多種頂復(fù)門原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)引發(fā)的疾病（包括弓形蟲(chóng)病和瘧疾）的新型治療策略提供了重要的分子基礎(chǔ)。通過(guò)靶向線粒體核糖體的關(guān)鍵蛋白，未來(lái)有望開(kāi)發(fā)出更高效、更特異藥物，為全球弓形蟲(chóng)病和瘧疾防治事業(yè)帶來(lái)新的希望。